NAD+ ir jo metabolitų kiekybinis įvertinimas pelės sėdimajame nerve
Įvadas
Nikotinamido adenino dinukleotido (NAD+) ir jo metabolitų svarba senėjimo ir neurodegeneracijos procesuose yra plačiai pripažinta. Siekiant paskatinti biocheminių tyrimų ir intervencijų, nukreiptų į senėjimą ir neurodegeneracines ligas, pažangą, labai svarbu tiksliai kiekybiškai įvertinti NAD+ ir jo metabolitų kiekį NAD+ gelbėjimo kelyje. Čia taikomas patikimas ir tikslus LC-MS/MS metodas, skirtas kiekybiškai įvertinti NAD+ ir jo metabolitų kiekį normaliame ir pažeistame pelės sėdimajame nerve.Esamų NAD+ ir jo metabolitų kiekybinio įvertinimo metodų apribojimai
Tradiciniai NAD+ ir jo metabolitų kiekybinio įvertinimo metodai, tokie kaip HPLC-UV, BMR, kapiliarinė zoninė elektroforezė arba kolorimetriniai fermentiniai tyrimai, susiduria su įvairiais iššūkiais dėl jautrumo, selektyvumo ir netiesioginio matavimo. Kalbant apie esamus LC-MS/MS tyrimus, skirtus ląstelių ar audinių NAD+ ir jo metabolitų matavimui, vis dar yra daug sunkumų, kuriuos reikia įveikti, pavyzdžiui, ilga analizės trukmė, prastas chromatografinės sulaikymo elgesys ir nepatenkinamos smailių formos. Be to, šiais metodais galima aprėpti tik vieną ar tris medžiagas NAD+ gelbėjimo kelyje.LC-MS/MS metodo modifikacijos
Remiantis esamais LC-MS/MS tyrimais, atliekamos chromatografinių sąlygų, pakaitinės matricos ir MS/MS sąlygų modifikacijos. Konkrečiai, 5 μM metileno fosfono rūgšties naudojama kaip judriosios fazės priedas, kuris aiškiai pagerina signalo intensyvumą ir smailės formą. Atsižvelgiant į gana švarią ir paprastą mėginių prigimtį bei jų mažą dydį, kaip pakaitinė matrica išbandomas itin grynas vanduo. Vietoj hidrofilinės sąveikos chromatografijos kolonėlės ir hiperkarbono kolonėlės naudojama Waters Atlantis Premier BEH C18 AX kolonėlė, kurios unikali MaxPeak HPS aukštos kokybės paviršiaus technologija (pasyvina kolonėlės vidinę sienelę, pašalina metalo paviršių) užtikrina aukštą atkuriamumą, smailių simetriją ir visų analičių bazinę atskyrimą.Be to, optimizuotos MS sąlygos, siekiant sumažinti NAD+ interferencijos signalą ciklinio adenozino difosfato ribozės (cADPR) kanale, išlaikant cADPR ir nikotinamido mononukleotido (NMN) atsaką, su 4000 V jonų purškimo įtampa, 450 ℃ turbokaitintuvo temperatūra, 50 psi dujoms 1, 50 psi dujoms 2, 30 psi užuolaidinėms dujoms ir 12 psi susidūrimo dujoms.
Reprezentatyvi nervų mėginių chromatograma (normalus vs pažeistas)
Visos penkios analitės pasiekia bazinę atskyrimą, kur cADPR yra jautrus biomarkeris neurodegeneracijos modelyje. Čia sėdimojo nervo aksotomija sukelia aksonų degeneraciją, dėl kurios sumažėja NAD+ kiekis ir padidėja NMN kiekis pažeistuose nervuose, todėl NMN/NAD+ santykis padidėja maždaug 2 kartus. Tuo pačiu metu nikotinamido (NAM) ir adenozino difosfato ribozės (ADPR) kiekiai sumažėja maždaug 2 kartus, o cADPR kiekis padidėja daugiau nei 8 kartus. Šie rezultatai atitinka anksčiau paskelbtų tyrimų rezultatus, patvirtindami šio modifikuoto LC-MS/MS metodo tikslumą kiekybiškai įvertinant NAD+ ir jo metabolitus.
Išvada
Šis modifikuotas LC-MS/MS metodas leidžia efektyviai atskirti NAD+, NMN, NAM, ADPR ir cADPR bazines linijas per trumpą 5 minučių analizės laiką, o tai prisideda prie ankstyvos įvairių neurologinių sutrikimų diagnostikos ir vaistų kūrimo senėjimo ir neurodegeneracinėms ligoms gydyti.Nuorodos
Ma Y, Deng L, Du Z. LC-MS/MS metodo, skirto kiekybiškai įvertinti NAD+ ir susijusius metabolitus pelių sėdimuosiuose nervuose, sukūrimas ir patvirtinimas bei jo taikymas nervų pažeidimo gyvūnų modelyje. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACnuo 2012 m. užsiima kofermentų ir natūralių produktų žaliavų moksliniais tyrimais, plėtra, gamyba ir pardavimu, turi savo gamyklas, daugiau nei 170 pasaulinius patentus bei stiprią mokslinių tyrimų ir plėtros komandą. BONTAC turi didelę mokslinių tyrimų ir plėtros patirtį bei pažangias technologijasNAD ir jo pirmtakų(pvz., NMN ir NR) biosintezės srityje. Yra įvairių NAD rūšių, iš kurių galima rinktis, įskaitant NAD ER klasės (endotoksinų šalinimas), NAD I klasės (IVD/maisto papildai/kosmetikos žaliavos milteliai), NAD II klasės (API/tarpiniai produktai) ir NAD IV klasės (jei yra didesni tirpumo reikalavimai), kurie gali būti tiekiami liofilizuotų miltelių arba kristalinių miltelių pavidalu. BONTAC NAD grynumas gali siekti daugiau nei 98%.
