NAD+ kiekybinis įvertinimas ir jo metabolitai pelės sėdimojo nervo viduje
Įvadas
Svarbios nikotinamido adenino dinukleotido (NAD+) ir jo metabolitų dalys senėjimo ir neurodegeneracijos procese yra plačiai pripažintos. Siekiant paskatinti pažangą biocheminiuose tyrimuose ir intervencijose, skirtose senėjimui ir neurodegeneracinėms ligoms, labai svarbu tiksliai kiekybiškai įvertinti NAD+ ir jo metabolitų lygius NAD+ gelbėjimo kelyje. Čia taikomas patikimas ir tikslus LC-MS/MS metodas, siekiant kiekybiškai įvertinti NAD+ ir jo metabolitų lygius normaliame ir pažeistame pelės sėdmeniniame nerve.Esamų NAD+ ir jo metabolitų kiekybinių metodų apribojimai
Tradiciniai NAD+ ir jo metabolitų kiekybiniai metodai, tokie kaip HPLC-UV, NMR, kapiliarinės zonos elektroforezė ar kolorimetriniai fermentiniai tyrimai, susiduria su įvairiais jautrumo, selektyvumo ir netiesioginio matavimo iššūkiais. Kalbant apie esamus LC-MS/MS tyrimus ląstelių ar audinių NAD+ ir jo metabolitų matavimams, vis dar yra daug sunkumų, kuriuos reikia įveikti, tokių kaip ilgesnis veikimo laikas, prastas chromatografinio sulaikymo elgsena ir nepatenkinamos piko formos. Be to, šiais metodais galima apimti tik vieną ar tris medžiagas NAD+ gelbėjimo kelyje.LC-MS/MS metodo modifikacijos
Remiantis esamais LC-MS/MS testais, atliekamos chromatografinių sąlygų, pakaitinės matricos ir MS/MS sąlygų modifikacijos. Konkrečiai, 5 μM metileno fosfono rūgšties naudojamas kaip judrios fazės priedas, kuris aiškiai skatina signalo intensyvumą ir piko formą. Atsižvelgiant į palyginti švarią ir paprastą niekada mėginių prigimtį bei jų mažą dydį, ultragrynas vanduo tiriamas kaip pakaitinė matrica. Vietoje hidrofilinės sąveikos skysčių chromatografijos kolonos ir hiperkarbonato kolonos naudojama Waters Atlantis Premier BEH C18 AX kolona, kurios unikali MaxPeak HPS aukštos kokybės paviršiaus technologija (pasyvuojant kolonos vidinę sienelę, pašalinant metalinį paviršių) leidžia užtikrinti aukštą atkuriamumą, piko simetriją ir bazinį atskyrimą visiems analitams. Be to, MS sąlygos optimizuotos siekiant sumažinti NAD+ interferencijos signalą cikliniame adenozindifosfato ribozės (cADPR) kanale, išlaikant cADPR ir nikotinamido mononukleotido (NMN) atsaką: 4000V jonų purškimo įtampai, 450°C turbo šildytuvo temperatūrai, 50 psi 1 dujai, 50 psi 2 dujai, 30 psi užuolaidinėms dujoms ir 12 psi susidūrimo dujoms.
Reprezentatyvus nervų mėginių chromatogramas (normalūs ir sužeisti)
Visi penki analitai pasiekia pradinį atskyrimą, kur cADPR yra jautrus biomarkeris neurodegeneracijos modelyje. Šiuo atveju sėdmeninio nervo aksotomija sukelia aksonų degeneraciją, dėl kurios sumažėja NAD+ lygis ir padidėja NMN lygis pažeistuose nervuose, dėl ko NMN/NAD+ santykis padidėja maždaug 2 kartus. Tuo pačiu metu nikotinamido (NAM) ir adenozino difosfato ribozės (ADPR) lygis sumažėja maždaug 2 kartus, o cADPR lygis padidėja daugiau nei 8 kartus. Šie rezultatai atitinka anksčiau paskelbtus tyrimus, patvirtinančius modifikuoto LS-MS/MS metodo tikslumą kiekybiškai vertinant NAD+ ir jo metabolitus.
Išvada
Šis modifikuotas LC-MS/MS metodas leidžia efektyviai atskirti NAD+, NMN, NAM, ADPR ir cADPR per trumpą 5 minučių laiką, kas prisideda prie ankstyvos įvairių neurologinių sutrikimų diagnozės ir vaistų kūrimo senėjimo bei neurodegeneracinėms ligoms gydyti.Nuoroda
Ma Y, Deng L, Du Z. LC-MS/MS metodo sukūrimas ir patvirtinimas NAD+ ir susijusių metabolitų kiekybiniam nustatymui pelių sėdmeniniuose nervuose bei jo taikymas nervų pažeidimo gyvūnų modelyje. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACnuo 2012 m. jis užsiima kofermentų ir natūralių produktų žaliavų MTEP, gamyba ir pardavimu, turi savarankiškas gamyklas, daugiau nei 170 pasaulinių patentų bei stiprią MTEP komandą. BONTAC turi didelę mokslinių tyrimų ir plėtros patirtį bei pažangias technologijas biosintezės srityjeNAD ir jo pirmtakai(pvz. NMN ir NR). Yra įvairių NAD tipų, įskaitant NAD ER laipsnį (endoksino šalinimas), NAD I laipsnį (IVD/maisto papildai/kosmetikos žaliavos milteliai), NAD II laipsnį (API/tarpiniai preparatai) ir NAD IV laipsnį (jei reikia didesnio tirpumo), kurie gali būti tiekiami liofilizuotų miltelių arba kristalinių miltelių pavidalu. BONTAC NAD grynumas gali viršyti 98%.
