Augimui susieta fermentų inžinerija manipuliuojant redokso kofaktoriaus regeneracija

Vis įvairesnis cheminių medžiagų spektras dabar gaminamas iš atsinaujinančių žaliavų biotechnologiniais būdais. Bioprocesai labai priklauso nuo fermentinės katalizės efektyviam šių junginių gamybai. Todėl užtikrinti, kad fermentai optimaliai veiktų reikiamoje aplinkoje, yra labai svarbu tvariai gamybai.

Savybės, tokios kaip substrato specifiškumas, katalizinis greitis ir (termo)stabilumas, yra keletas svarbių veiksnių, kuriuos reikia optimizuoti efektyviems fermentų valdomiems bioprocesams. Ši optimizacija gali būti daug laiko reikalaujanti, brangi ir sudėtinga, todėl veiksminga ir ekonomiškai efektyvi augimo susieta atranka, inžineriniai fermentai su pageidaujamomis savybėmis yra labai paklausūs.

Augimo susietos atrankos privalumai kaip fermentų atrankos formos, kai fermento aktyvumas susiejamas su ląstelės augimu. Šis metodas gali būti naudojamas kaip didelio pralaidumo atrankos strategija ir pasiekiamas užtikrinant, kad augimas priklausytų nuo tikslinio fermento produkto sintezės, arba susiejant fermento aktyvumą su ląstelės pasauline energijos būsena. Sintetinė biologija gali būti naudojama kuriant štamus, tinkamus augimui susietai atrankai, o naujausi pasiekimai sutelkti į padermių, kuriems trūksta oksiduotų ar sumažintų redoks kofaktorių porų būsenų, inžineriją, kurios gali tapti fermentų inžinerijos platformomis. Šių platformų naudojimas gali paspartinti patobulintų biokatalizatorių ir bioprocesų kūrimą.

Augimo sąveikos per kofaktorių auxotrofiją privalumai

Kofaktoriaus auxotrofijos naudojimo kaip atrankos metodo inžinerijoje fermentų, dalyvaujančių tam tikrų cheminių medžiagų, tokių kaip lipidai, biokuras, dujos, organiniai tirpikliai ar polimeriniai junginiai, inžinerija. Šis metodas suteikia keletą unikalių privalumų, įskaitant galimybę nepriklausomai pasirinkti norimą produktą nepriklausomai nuo dominančio substrato ar produkto, taip palengvinant padidėjusio fermentų aktyvumo aptikimą ir siūlant rodmenis padidėjusiam fermentiniam aktyvumui nustatyti. Be to, kofaktorių auxotrofų naudojimas kaip augimo sujungimo platformų yra naudingas, nes redoks kofaktorių visur paplitęs mikrobų metabolizme reiškia, kad inžinerinės strategijos gali būti šoniniu būdu perduodamos kitiems dominantiems mikrobams, o fermentai gali būti tiesiogiai inžineriniai norimos mikroorganizmų šeimininko aplinkoje. (pavaizduota 1 pav.)

1 pav.: Kelių plačiai naudojamų atrankos/atrankos metodų fermentų inžinerijai palyginimas

Mutantai, kuriems trūksta NADH oksidacijos

NADH oksidacija E. coli gali vykti dviem būdais, priklausomai nuo deguonies prieinamumo. Aerobinėmis sąlygomis NADH daugiausia oksiduojamas kvėpuojant ir gaminant ATP, o anaerobinėmis sąlygomis jis gali būti oksiduojamas fermentacijos keliais, gamindamas laktatą ir etanolį. E. coli mutantinės atmainos, negalėjusios naudoti mišrių fermentacijos kelių NADH oksidacijai anaerobinio augimo metu, buvo naudojamos NADH oksidavimo keliams anaerobiniam įvairių cheminių medžiagų, tokių kaip 2-metilpropan-1-ol, 2,3-butanediolio, 1-butanolio ir L-alanino, sintezei. Šios mutantinės padermės taip pat buvo naudojamos fermentų inžinerijai, pasitelkiant panašius redoks principus, dėl ko pagerėjo variantai. Gautos padermės gali būti naudojamos kitų NAD(P)H priklausomų fermentų ir kelių inžinerijai.

Mutantai, kuriems trūksta NAD+ redukcijos  

Wenk ir kt. sukūrė E. coli štamą, pašalindami dihidrolipoildehidrogenazės (LPD) geną, dėl ko štamas negalėjo generuoti redukuojančios galios (NADH ir NADPH) iš acetato metabolizmo dėl piruvato dehidrogenazės aktyvumo nebuvimo. Dėl to deformacija rodė auxotrofiją, mažinančią galią, kai aerobiškai auginama acetate kaip vieninteliame anglies šaltinyje. (pavaizduota 2 pav.) Štamas galėjo augti ant acetato, kai buvo papildytas viršutiniais glikoliziniais substratais arba ekspresuojant NAD+-priklausomas formate-, etanolio ar metanolio dehidrogenazes su atitinkamais substratais. Ši atmaina nebuvo naudojama fermentų inžinerijai ir buvo vertinama tik dėl redoks kofaktoriaus auxotrofijos.
 

2 pav.: Centrinė medžiagų apykaita 

Mutantai, kuriems trūksta NADPH oksidacijos

Yra dvi skirtingos strategijos, kaip sukelti NADP+ auxotrofiją E. coli, kurios remiasi glikolizinio kelio inžinerija, kad NADPH būtų pergaminta. Pirmoji strategija apima natūralaus gapA geno pašalinimą ir heterologinio NADP+ priklausomo GAPDH fermento ekspresiją, o antroji strategija – anglies srauto nukreipimą per pentozės fosfato kelią. Susidariusios padermės negali augti ant gliukozės, tačiau auga skirtingomis sąlygomis: pirmoji atmaina auginama anaerobinėmis sąlygomis, antroji – aerobinėmis sąlygomis, kur pagrindas yra glicerolis. Šios rūšys naudojamos fermentų, turinčių patobulintas savybes, įskaitant substrato specifiškumą, katalizinį aktyvumą ir termostabilumą, inžinerijai.

Mutantai, kuriems trūksta NADP+ redukcijos

Trys skirtingos bakterijos – E. coli, P. putida ir C. glutamicum – buvo inžinerinės kaip NADPH-auxotrofinės, tai reiškia, kad joms augimui reikalingas išorinis NADPH. E. coli ir C. glutamicum atveju centriniai metaboliniai fermentai buvo išjungti, kad būtų išvengta NADP+ redukcijos, kai gliukozė buvo tiekiama kaip anglies šaltinis, o P. putida atveju CRISPR/nCas9 pagalba inžinerija buvo panaudota siekiant nuosekliai sutrikdyti taikinių genų rinkinius, siekiant suprasti jų dalyvavimą redoks metabolizme. NADPH-auxotrofinės padermės vėliau buvo naudojamos augimui susietų fermentų inžinerijai, remiantis kofaktoriaus specifiškumu. Vienas mutagenezės raundas naudojant E. coli davė efektyviausią ir specifiškiausią NADP+ priklausomą formiate dehidrogenazę iki šiol, o P. putida ir C. glutamicum yra pirmosios savo rūšies atmainos, galinčios būti naudojamos tokio tipo inžinerijai.

Mutantai, kuriems trūksta NMN+ redukcijos

Buvo sukurta augimo susieta atrankos sistema, siekiant susieti kofaktorių ciklą ir augimą, pagrįstą NMN+ redukcijos trūkumu. Naudota E. coli SHuffle atmaina, kuri neša delecijas dviejuose genuose, dalyvaujančiuose redukuoto glutationo gamyboje. NMNH priklausoma glutationo reduktazė buvo sukurta racionalios mutagenezės būdu, siekiant susieti procesą su NMN+/NMNH ciklu, o NMN+ priklausoma gliukozės dehidrogenazė buvo panaudota NMN+/NMNH kofaktorių ciklui palaikyti ir taip augimui palaikyti. Tyrime taip pat pirmą kartą buvo taikyta nekanoninė redokso kofaktoriaus auxotrofija augimui susietai fermentų inžinerijai, dėl ko buvo sukurta termostabili fosvitų dehidrogenazės variacija, pasižyminti pagerintu kataliziniu efektyvumu ir laiko stabilumu in vitro. Šis darbas suteikia naudingą štamą augimui susietos fermentų inžinerijos srityje, priklausantį nuo NMN+/NMNH ciklo ir auxotrofinį nekanoninio redokso kofaktoriaus sumažintos būsenos atžvilgiu.

Augimo susiejimo per redoks kofaktorius potencialas veikė kaip galingas įrankis biokatalizatorių inžinerijai, ypač tvarios bioprodukcijos kontekste. Nors redokso kofaktoriaus auxotrofinių štamų generavime pasiekta nemažai pažangos, teiginys rodo, kad vis dar yra keletas neištirtų tyrimų krypčių. Viena iš jų apima kitų organizmų, išskyrus E. coli, kofaktoriaus auxotrofinių štamų inžineriją, kas galėtų atverti naujas galimybes augimui susietai fermentų inžinerijai.

Apskritai, tai rodo, kad redokso kofaktorių pagrindu veikiančio augimo susiejimo naudojimas yra didelė galimybė inžinerinei biokatalizei, ypač gaminant produktus, kurie negali atitikti kitų didelio pralaidumo fermentų inžinerijos metodų reikalavimų. Pabrėžiama būtinybė kurti universalesnius ir efektyvesnius biokatalizatorius tvariai biogamybai ir pabrėžiama tęstinių tyrimų šioje srityje svarba.


Šaltinis: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Augimui susieta fermentų inžinerija manipuliuojant redokso kofaktoriaus regeneracija, Biotechnology Advances, 2023.