Su augimu susijusi fermentų inžinerija manipuliuojant redokso kofermentų regeneracija

Vis didesnis cheminių medžiagų asortimentas dabar gaminamas iš atsinaujinančių žaliavų biotechnologinėmis priemonėmis. Bioprocesai labai priklauso nuo fermentų katalizės, kad šie junginiai būtų efektyviai gaminami. Todėl užtikrinti, kad fermentai optimaliai veiktų reikiamoje aplinkoje, yra labai svarbu tvariam gamybai.

Tokios savybės kaip substrato specifiškumas, katalizės greitis ir (termo)stabilumas yra vieni iš kelių kritinių veiksnių, kuriuos reikia optimizuoti efektyviems fermentais pagrįstiems bioprocesams. Šis optimizavimas gali būti daug laiko reikalaujantis, brangus ir sudėtingas, todėl veiksmingi ir ekonomiškai naudingi būdai, tikėtina, augimo susietam atrankai, inžinerijai fermentų su pageidaujamomis savybėmis yra labai ieškomi.

Augimo susietos atrankos, kaip fermentų atrankos formos, privalumai, kurie apima fermento aktyvumo susiejimą su ląstelės augimu. Šis metodas gali būti naudojamas kaip didelio pralaidumo atrankos strategija ir gali būti pasiektas arba užtikrinant, kad augimas priklausytų nuo produkto sintezės tikslinio fermento, arba susiejant fermento aktyvumą su globalia ląstelės energijos būsena. Sintetinė biologija gali būti naudojama kuriant padermes, tinkamas augimo susietai atrankai, o naujausi pasiekimai buvo sutelkti į padermių, turinčių trūkumų oksiduotose ar redukuotose redokso kofaktorių porų būsenose, inžineriją, kurios gali tarnauti kaip fermentų inžinerijos platformos. Šių platformų naudojimas gali paspartinti patobulintų biokatalizatorių ir bioprocesų kūrimą.

Augimo susiejimo per kofaktorių auksotrofiją privalumai

Kofaktorių auksotrofijos, kaip atrankos metodo, naudojimo privalumai inžinerijai fermentų, dalyvaujančių tam tikrų cheminių medžiagų, tokių kaip lipidai, biokuras, dujos, organiniai tirpikliai ar polimeriniai junginiai, biosintezėje. Šis metodas siūlo keletą unikalių privalumų, įskaitant galimybę atrinkti norimą produktą nepriklausomai nuo dominančio substrato ar produkto, todėl lengviau aptikti pagerintą fermentų aktyvumą, ir suteikia rodiklį pagerinto fermentų aktyvumo aptikimui. Be to, kofaktorių auksotrofų naudojimas kaip augimo susiejimo platformų yra naudingas, nes redokso kofaktorių visur paplitimas mikrobų metabolizme reiškia, kad inžinerijos strategijos gali būti horizontaliai perkeliamos į kitus dominančius mikrobus, o fermentai gali būti tiesiogiai inžineruojami norimo mikrobų šeimininko aplinkoje. (parodyta 1 paveiksle)

1 paveikslas: kelių plačiai naudojamų atrankos/atrankos metodų palyginimas fermentų inžinerijai

Mutantai, turintys NADH oksidacijos trūkumą

NADH oksidacija E. coli gali vykti dviem būdais, priklausomai nuo deguonies prieinamumo. Aerobinėmis sąlygomis NADH daugiausia oksiduojamas per kvėpavimą, kad būtų generuojamas ATP, o anaerobinėmis sąlygomis jis gali būti oksiduojamas per fermentacijos kelius, kad būtų gaminami laktatas ir etanolis. E. coli mutantinės padermės, negalinčios naudoti mišrių fermentacijos kelių NADH oksidacijai anaerobinio augimo metu, buvo naudojamos NADH oksiduojantiems keliams skatinti anaerobinę įvairių cheminių medžiagų, tokių kaip 2-metilpropan-1-olis, 2,3-butandiolis, 1-butanolis ir L-alaninas, sintezę. Šios mutantinės padermės taip pat buvo naudojamos fermentų inžinerijai, išnaudojant panašius redokso principus, todėl buvo gauti patobulinti variantai. Gautos padermės gali būti naudojamos kitų NAD(P)H priklausomų fermentų ir kelių inžinerijai.

Mutantai, turintys NAD+ redukcijos trūkumą

Wenk ir kt. sukūrė E. coli padermę, ištrindami dihidrolipoil dehidrogenazės (lpd) geną, dėl ko padermė negalėjo generuoti redukuojančios galios (NADH ir NADPH) iš acetato metabolizmo dėl piruvato dehidrogenazės aktyvumo nebuvimo. Tai lėmė, kad padermė rodė redukuojančios galios auksotrofiją, kai aerobiškai auginama ant acetato kaip vienintelio anglies šaltinio. (parodyta 2 paveiksle) Padermė galėjo augti ant acetato, kai buvo papildyta viršutiniais glikolitiniais substratais arba kai buvo ekspresuojami NAD+-priklausomi formiat-, etanol- ar metanol dehidrogenazės su atitinkamais substratais. Padermė nebuvo naudojama fermentų inžinerijai ir buvo įvertinta tik dėl redokso kofaktorių auksotrofijos.
 

2 paveikslas: Centrinis metabolizmas

Mutantai, turintys NADPH oksidacijos trūkumą

Yra dvi skirtingos strategijos, kaip sukelti NADP+ auksotrofiją E. coli, remiantis glikolitinio kelio inžinerija, kad būtų perprodukuojamas NADPH. Pirmoji strategija apima natūralaus gapA geno ištrynimą ir heterologinio NADP+-priklausomo GAPDH fermento ekspresiją, o antroji strategija apima anglies srauto nukreipimą per pentozės fosfato kelią. Gautos padermės negali augti ant gliukozės, bet rodo augimą skirtingomis sąlygomis, pirmoji padermė auginama anaerobinėmis sąlygomis, o antroji aerobinėmis sąlygomis su gliceroliu kaip substratu. Šios padermės naudojamos fermentų su pagerintomis savybėmis, įskaitant substrato specifiškumą, katalizinį aktyvumą ir termostabilumą, inžinerijai.

Mutantai, turintys NADP+ redukcijos trūkumą

Trys skirtingos bakterijos, E. coli, P. putida ir C. glutamicum, buvo sukurtos taip, kad būtų NADPH-auksotrofinės, tai reiškia, kad jos reikalauja egzogeninio NADPH augimui. E. coli ir C. glutamicum atveju centriniai metaboliniai fermentai buvo išmušti, kad būtų išvengta NADP+ redukcijos, kai gliukozė buvo teikiama kaip anglies šaltinis, o P. putida atveju CRISPR/nCas9 pagalba atlikta inžinerija buvo naudojama nuosekliai sutrikdyti tikslinių genų rinkinius, siekiant suprasti jų vaidmenį redokso metabolizme. NADPH-auksotrofinės padermės vėliau buvo naudojamos augimo susietai fermentų inžinerijai, pagrįstai kofaktorių specifiškumu. Vienas mutagenezės raundas naudojant E. coli davė efektyviausią ir specifiškiausią iki šiol NADP+-priklausomą formiat dehidrogenazę, o P. putida ir C. glutamicum yra pirmosios savo rūšies padermės, kurios gali būti naudojamos tokio tipo inžinerijai.

Mutantai, turintys NMN+ redukcijos trūkumą

Buvo sukurta augimo susiejimo sistema, skirta susieti kofaktoriaus ciklą ir augimą, remiantis NMN+ redukcijos trūkumu. Buvo naudojama E. coli SHuffle padermė, turinti dviejų genų, susijusių su redukuoto glutationo gamyba, delecijas. NMNH priklausoma glutationo reduktazė buvo sukurta racionalios mutagenezės būdu, siekiant susieti procesą su NMN+/NMNH ciklu, o NMN+ priklausoma gliukozės dehidrogenazė buvo naudojama palaikyti NMN+/NMNH kofaktoriaus ciklą ir taip pat augimą. Tyrimas taip pat pirmą kartą pritaikė nekanoninio redokso kofaktoriaus auksotrofiją augimo susietam fermentų inžinerijos metodui, todėl buvo gautas termostabilus fosfito dehidrogenazės variantas su pagerintu katalitiniu efektyvumu ir laiko stabilumu in vitro. Darbas suteikia naudingą padermę augimo susietam fermentų inžinerijos metodui, priklausomą nuo NMN+/NMNH ciklo ir auksotrofinę redukuotai nekanoninio redokso kofaktoriaus būsenai.

Augimo susiejimo per redokso kofaktorius potencialas pasirodė esąs galinga priemonė biokatalizatorių inžinerijai, ypač tvarios bioprodukcijos kontekste. Nors buvo padaryta didelė pažanga kuriant redokso kofaktoriaus auksotrofines padermes, teiginys rodo, kad vis dar yra keletas neištirtų tyrimų krypčių. Viena iš jų apima kitų nei E. coli organizmų kofaktoriaus auksotrofinių padermių inžineriją, kuri galėtų atverti naujas galimybes augimo susietam fermentų inžinerijos metodui.

Apskritai, tai rodo, kad redokso kofaktoriais pagrįsto augimo susiejimo naudojimas yra didelė galimybė biokatalizės inžinerijai, ypač gaminant produktus, kurie negali atitikti kitų didelio pralaidumo fermentų inžinerijos metodų reikalavimų. Tai pabrėžia poreikį sukurti universalesnius ir efektyvesnius biokatalizatorius tvariam bioprodukcijai ir pabrėžia nuolatinio tyrimo šioje srityje svarbą.


Nuoroda: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Growth-coupled enzyme engineering through manipulation of redox cofactor regeneration, Biotechnology Advances, 2023.