Reakcijos sąlygų optimizavimas, siekiant pasiekti aukštą stevijos rebaudiosidų D išeigą
Daug cukraus turinčios dietos lėmė įvairių lėtinių ligų, įskaitant nutukimą, diabetą, širdies ir kraujagyslių ligas bei hipertenziją, paplitimą, kas kelia didelę pasaulinę visuomenės sveikatos problemą. Stevia Rebaudioside D (Reb D), natūralus saldiklis, gaunamas iš augalų, sulaukė didelio dėmesio kaip cukraus pakaitalas dėl savo nulinio kalorijų kiekio, intensyvaus saldumo ir malonaus skonio profilio.
Tačiau ribotas jos buvimas stevia rebaudiana Bertoni ir iššūkiai, susiję su augalinės kilmės glikoziltransferazės mažu tirpumu ir fermentiniu aktyvumu, trukdė plačiam jos komerciniam taikymui. Atsakydama į šias problemas, buvo atrasta nauja glikoziltransferazė YojK, kilusi iš Bacillus subtilis 168. Šiame tyrime pristatoma genetiškai modifikuota bakterinė glikoziltransferazė YojK-I241T/G327N, pasižyminti dideliu tirpumu ir kataliziniu efektyvumu, suteikiančiu didelį potencialą pramoninio masto Reb D gamybai.
Labai efektyvaus rebaudiozido D gamybos metodo sukūrimas, naudojant YojK-I241T/G327N ir AtSuSy fermentų kaskadinę reakciją.
Siekiant spręsti mažo tirpumo augalinėse glikoziltransferazėse problemą, tyrėjai tyrė YojK, O-glikoziltransferazės iš Bacillus subtilis 168, naudojimo galimybes. YojK buvo pasirinktas dėl įrodyto glikozilinimo aktyvumo su įvairiais substratais, įskaitant dideles molekules. Po sėkmingos rekombinantinės ekspresijos ir išgryninimo YojK buvo panaudotas Reb A glikozilavimui, dėl ko susidarė Stevia Reb D. Fermentų kinetinė analizė parodė, kad YojK turi mažesnį katalizinį aktyvumą Reb D atžvilgiu, palyginti su kitomis glikoziltransferazėmis. Todėl tyrimas rodo struktūromis valdomos inžinerijos būtinybę, siekiant sustiprinti YojK katalizinį aktyvumą potencialioms praktinėms taikymo galimybėms. (kaip parodyta 1 pav.)
1 pav.
Reakcijos sąlygų optimizavimas, siekiant pasiekti didelį rebaudiozido D išėjimą.
Reakcijos sąlygos, įskaitant pH, temperatūrą ir substrato koncentraciją, gali būti optimizuotos, kad būtų pasiektas didelis Srevia Reb D išeiga. Tyrime buvo naudojamos molekulinės dinamikos simuliacijos, siekiant ištirti, kaip YojK-I241T/G327N variantas sustiprina Reb D glikozilinimą. Variantas simuliacijų metu išlaikė stabilų vandenilinį ryšį tarp Reb A ir H14, skirtingai nei laukinio tipo (kaip parodyta 2 pav.). Šis stabilumas taip pat pasireiškė atstumu tarp Reb A O2 atomo ir UDPG C1P. YojK-I241T/G327N varianto pagerintas katalizinis efektyvumas buvo priskirtas šioms stabilioms sąveikoms, kas rodo jo praktinį potencialą.
2 pav.
3 pav.
Išvada
Šis metodas davė 83,47 % Reb D. Svarbu paminėti, kad pridėjus 1 mM UDPG buvo galima sintezuoti 20,59 g/l Reb D su įspūdingu 91,29 % išeigumu, pranokstančiu ankstesnius tyrimus. Šis procesas parodo pramoninio masto Reb D gamybos potencialą, ypač po YojK struktūrinės inžinerijos.YojK gali būti efektyviai išreikštas E. coli BL21 (DE3) su dideliu tirpumu. Struktūromis valdomos inžinerijos dėka buvo sukurtas dvigubas mutantas YojK-I241T/G327N, leidžiantis didelio masto Reb D gamybą su išskirtiniu 91,29 % derliumi, perdirbant UDPG, katalizuotą sacharozės sintazės AtSuSy. Šiame tyrime YojK-I241T/G327N pristatomas kaip perspektyvus įrankis ekonomiškai efektyviai pramoninio masto Reb D gamybai.
