Reakcijos sąlygų optimizavimas siekiant didelės stevijos rebaudiozido D išeigos
Didelio cukraus kiekio dietos lėmė didėjantį įvairių lėtinių ligų paplitimą, įskaitant nutukimą, diabetą, širdies ir kraujagyslių ligas bei hipertenziją, o tai kelia didelį susirūpinimą pasaulinei visuomenės sveikatai. Stevijos rebaudiozidas D (Reb D), natūralus saldiklis, gaunamas iš augalų, sulaukė didelio dėmesio kaip cukraus pakaitalas dėl savo nulinio kaloringumo, intensyvaus saldumo ir malonaus skonio profilio.
Tačiau jo ribotas kiekis Stevia rebaudiana Bertoni ir su mažu tirpumu bei fermentiniu aktyvumu susiję iššūkiai, kylantys iš augalų kilmės glikoziltransferazių, trukdė plačiam komerciniam pritaikymui. Reaguojant į šias problemas, buvo atrastas naujas glikoziltransferazės fermentas, vadinamas YojK, kilęs iš Bacillus subtilis 168. Šiame tyrime pristatomas genetiškai modifikuotas bakterinis glikoziltransferazės fermentas YojK-I241T/G327N, pasižymintis dideliu tirpumu ir katalitiniu efektyvumu, suteikiantis didelį potencialą pramoninei Reb D gamybai.
Sukurta labai efektyvi rebaudiozido D gamybos metodika, naudojant YojK-I241T/G327N ir AtSuSy fermentų kaskadinę reakciją.
Siekiant išspręsti mažo tirpumo problemą, susijusią su augalų kilmės glikoziltransferazėmis, mokslininkai ištyrė galimybę naudoti YojK – O-glikoziltransferazę iš Bacillus subtilis 168. YojK buvo pasirinktas dėl jo įrodyto glikozilinimo aktyvumo su įvairiais substratais, įskaitant dideles molekules. Po sėkmingos rekombinantinės ekspresijos ir išgryninimo, YojK buvo panaudotas Reb A glikozilinimui, todėl buvo gautas Stevijos Reb D. Fermentų kinetikos analizė atskleidė, kad YojK turi mažesnį katalitinį aktyvumą Reb D atžvilgiu, palyginti su kitomis glikoziltransferazėmis. Todėl tyrime siūloma būtinybė taikyti struktūros nukreiptą inžineriją, siekiant padidinti YojK katalitinį aktyvumą potencialiam praktiniam pritaikymui. (kaip parodyta 1 paveiksle)
1 paveikslas
Reakcijos sąlygų optimizavimas siekiant didelės rebaudiozido D išeigos.
Reakcijos sąlygos, įskaitant pH, temperatūrą ir substrato koncentraciją, gali būti optimizuotos siekiant didelės Stevijos Reb D išeigos. Tyrimas naudojo molekulinės dinamikos modeliavimą, siekiant ištirti, kaip YojK-I241T/G327N variantas pagerina Reb D glikozilinimą. Variantas išlaikė stabilų vandenilinį ryšį tarp Reb A ir H14 modeliavimo metu, skirtingai nei laukinio tipo fermentas (kaip parodyta 2 paveiksle). Šis stabilumas taip pat apėmė atstumą tarp Reb A O2 atomo ir UDPG C1P. YojK-I241T/G327N varianto pagerintas katalitinis efektyvumas buvo priskirtas šioms stabilioms sąveikoms, o tai rodo jo praktinį potencialą.
2 paveikslas
3 paveikslas
Išvada
Šis metodas davė 83,47% Reb D. Pažymėtina, kad pridėjus 1 mM UDPG buvo galima susintetinti 20,59 g/L Reb D su nepaprasta 91,29% išeiga, viršijančia ankstesnius tyrimus. Šis procesas parodo pramoninės Reb D gamybos potencialą, ypač po struktūrinės YojK inžinerijos.YojK gali būti efektyviai ekspresuojamas E. coli BL21 (DE3) su dideliu tirpumu. Taikant struktūros nukreiptą inžineriją, buvo sukurtas dvigubas mutantas YojK-I241T/G327N, leidžiantis didelės apimties Reb D gamybą su išskirtine 91,29% išeiga, perdirbant UDPG, katalizuojamą sacharozės sintazės AtSuSy. Šis tyrimas pristato YojK-I241T/G327N kaip perspektyvų įrankį ekonomiškai efektyviai pramoninei Reb D gamybai.
